1 ... 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Microsoft Word 63770195-file00 - səhifə 11

səhifə11/16
tarix22.07.2018
ölçüsü415.05 Kb.

24 

 

SR SIM and WF included diode laser 488-100 (488nm). Images were captured with an EM-CCD 

608 

camera (Andor iXON EM+; 1004x1002 px, cooled at -64°C, 16-bit) at typical exposure times 

609 

varying between 80-200 ms and with gain values between 20-25. High performance SR-SIM 

610 

setup included 5 rotations and 5 phases of the grated pattern for each image layer. Gratings for 

611 

patterned illumination were spaced by 42 µm for the 100x/NA1.57 oil immersion objective. Up 

612 

to 7 (usually 3) Z-stacks were acquired per image with a slice thickness of 110nm for the 

613 

100x/NA1.57 objectives. Light source for CLSM included Argon-Neon Laser (458, 488 and 514 

614 

nm). Images were captured using GaAsP spectral detector, scanning speed 4, line averaging 4 

615 

and pinhole: 1airy unit. CLSM was setup to meet the SR-SIM magnification (1008x and 1600x 

616 

depending on the objective) in the optimum pixel resolution (according to Nyquist sampling 

617 

criteria). 

618 

For time lapsed imaging with SIM the Alpha Plan Apochromat 100x/NA1.57 oil objective was 

619 

exclusively used and images were acquired from a single optical section. Grid rotations were 

620 

reduced from 5 to 3 and the exposure time of the EM-CCD was reduced to minimum. In this 

621 

way, time interval was 2.6 seconds and this value was used as a standard for WF (acquired 

622 

simultaneously with SIM), CLSM, SD and TIRF in order to ensure similar temporal resolution 

623 

employing the same objective. 

624 

SIM, WF, CLSM and TIRF platforms are integrated in the Zeiss Elyra PS.1 system used hereby, 

625 

therefore it was possible to acquire sequential time-lapsed series exactly from the same cell with 

626 

the aforementioned microscopies. Spinning disc microscopy was conducted using an 

627 

independent microscopy platform equipped with the Zeiss Axio Observer inverted microscope 

628 

combined with a Yokogawa CSU-X1 scanning head. The same Alpha Plan Apochromat 

629 

100x/NA1.57 oil objective, cover slips and immersion oil (Nexterion high precision coverslips 

630 

and high refractive index Immersol HI as used for acquisition of SIM images) were used for 

631 

bioimaging with this system. Images were acquired by high resolution camera Evolve 512 black-

632 

thinned EM-CCD (Photometrics). 

633 

Image processing and quantitative analysis 

634 


Raw CLSM, WF and SR SIM images were acquired with Zeiss Zen 11 software (Zen Blue 

635 


version, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena). Measurements involving intensity profiles of 

636 


 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

25 

 

individual microtubules or microtubule bundles were directly conducted in Zen 11. For multiple 

637 

measurements, the original line selected for intensity profiling was cloned with the appropriate 

638 

Zen 11 tool to different positions of the same or other individual or bundled microtubules in the 

639 

image. To alleviate for differences in absolute intensity values between WF, SIM and CLSM 

640 

images, raw values were exported to MS Excel, normalized to a range between 0 and 1 and 

641 

plotted against distance. Scatter plots of normalized intensity values vs distance were used to 

642 

measure FWHM with Image J. 

643 

To quantitatively address bundle structure by means of maximum absolute fluorescence 

644 

intensity, line profiles were drawn perpendicular to cortical microtubule bundles acquired by 

645 

SIM (as depicted in Figs. 2A, D, G), based on visual inspection of the actual individual 

646 

microtubules converging to such bundles, to avoid user bias on placing profiles based on 

647 

intensity values. The respective profiles were then exactly copied to the corresponding WF 

648 

image and the sequentially acquired CLSM image (appx. 2 min after the simultaneous 

649 

acquisition of the SIM/WF image). This was done because absolute fluorescence intensities of 

650 

individual microtubules visualized by WF and CLSM showed broad variability, thus absolute 

651 

fluorescence intensity could not serve as a predictor to decide the placement of the profile as to 

652 

correspond the microtubule number independently for WF and CLSM. 

653 

Kymographs of dynamic microtubules were generated by three alternative ways: either by using 

654 

the time profile tool of the Zen 2011 blue version, or in Image J, on line selections of time stacks 

655 

subsequently resliced, or by using the MultipleKymograph plugin for Image J 

656 

(http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html) developed by J. Rietdorf and A. Seitz 

657 

(European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany). Quantitative analysis of 

658 

kymographs was done again in ImageJ using the Kymoquant plugin 

659 

(http://cmci.embl.de/downloads/kymoquant) written by Koto Miura (European Molecular 

660 

Biology Laboratory, Heidelberg, Germany). 

661 

Catastrophe and rescue frequencies were calculated according to previously published work 

662 

(Dhonukshe and Gadella, 2003). Briefly, total number of events (summed from as many 

663 

individual microtubules as reported in text) was divided by total amount of time required for 

664 

  www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.


:

content
content -> Schizophrenie
content -> DiNİ geliŞİM
content -> Kişisel arzu, istek ve ihtiyaçları için pazarlama bileşenlerini satın alan ya da satın alma kapasitesinde olan kişidir


Dostları ilə paylaş:

©2018 Учебные документы
Рады что Вы стали частью нашего образовательного сообщества.
?


nueces-county--texas--.html

nuestra-senora-de-lya.html

nueva-ofensiva-desde-las-2.html

nuevas-constituciones.html

nuevas-tecnologas-al.html